在生物医学研究中，无论是体外难以感染的细胞慢病毒文库，还是体内的AAV文库，确保一个靶点仅进入一个细胞一直是科研工作者面临的难题。文库实验旨在探索单基因引发的功能变化，因此必须控制每个细胞仅感染携带单一靶点的病毒。这就要求在细胞实验中，开始时以对照病毒进行预实验，以摸索最佳的感染比率（MOI），通常选择感染效率达到80%的MOI。文库操作时的MOI则设置为最佳MOI的三分之一，从而减少病毒用量，以控制每个细胞接收病毒的数量，这种策略能够有效降低重复感染的风险。

然而，在一些难以感染的细胞（如免疫细胞）和体内实验中，如何合理确定最佳剂量以确保每个靶点只进入一个细胞依然充满挑战。这是因为最佳MOI的感染效率可能低至30%。如果按三分之一的用量，实际上将会难以获得感染成功的细胞。在这一背景下，环亚集团·AG88推出的三色荧光病毒（包括mTagBFP、Venus、mCherry）为研究者提供了更为有效的文库感染预实验的解决方案。

三色荧光病毒的设计参考了文献《Transcriptional linkage analysis within vivo AAV-Perturb-seq》。研究中，作者通过体内滴定实验探索AAV在低感染复数下感染众多细胞的可能性，制备了不同剂量的AAV，具体量为25E9、5E9及5E10颗粒数，采用phpb血清型。病毒构建方案由CBh启动子控制，独立表达mTagBFP、Venus及mCherry。流式细胞筛选技术使研究者能够确定更低剂量同时减少双病毒感染同一细胞的机会，最终选择了5E9颗粒的剂量，使单个AAV感染的细胞总数最大化。

在医学研究中，该三色实验法允许将三种AAV的等比例混合物注射到不同剂量的LSL-Cas9动物中（低剂量：25E9；中剂量：50E9；高剂量：25E10），通过比较不同剂量下的感染细胞核百分比以及表达1个、2个或3个荧光的感染细胞核百分比，以此来优化最佳剂量。全身注射50E9颗粒后，针对GFP表达的脑细胞进行荧光成像，以提供有效的实验依据。

综上所述，环亚集团·AG88所推出的三色荧光病毒能够在细胞实验及动物实验中广泛应用，为研究人员在不同剂量下进行实验提供了便捷的平台。通过流式细胞分析，确定单病毒感染比例最高且感染细胞数量较大的剂量作为最佳实验剂量，从而为后续的文库实验打下坚实基础。

【参考文献】Santinha, AJ, Klingler, E, Kuhn, M et al. Transcriptional linkage analysis within vivo AAV-Perturb-seq. Nature 622, 367–375 (2023)