稀释法测定最小抑菌浓度（MIC）是评估抗菌剂对微生物生长抑制能力的重要实验技术。常用的方法包括微量稀释法和常量肉汤稀释法。其中，琼脂稀释法因其操作简便、成本低廉且适合高通量筛选，尤其适合自动化操作及精确控制药物浓度而受到广泛应用。而肉汤稀释法则以其直观、易于操作而适合实验室规模的测试，并能根据实验需求灵活调整药物浓度和培养基体积。

琼脂稀释法

1. 原理

本实验采用琼脂稀释法，将不同浓度的抑菌剂混合溶解在琼脂培养基中，然后接种细菌，通过观察细菌的生长状况来确定抗（抑）菌物质抑制受试菌生长的最低浓度，即最小抑菌浓度（Minimal Inhibitory Concentration，MIC）。此方法非常适用于不溶性抗（抑）菌产品。

2. 操作步骤

1. 抗（抑）菌溶液的配制：采用无菌操作取5ml或5g（固体研磨后）样品，放入45ml灭菌磷酸缓冲液中，充分震荡溶解，以制备10%的均匀分散的溶液或悬液。
2. 抗菌剂培养基的配制：将已配制的10%抗（抑）菌溶液用PBS进行对倍系列稀释，制成不同浓度的受试液，置于45℃～50℃水浴中恒温备用。
3. 双倍浓度培养基的配制：称取76g MH琼脂培养基，溶于1000ml水中，加热至沸腾并完全溶解。然后在121℃下进行压力蒸汽灭菌15分钟，最后置于45℃～50℃水浴备用。
4. 含抗（抑）菌液培养基的配制：取10ml系列稀释的抗菌液加入平皿，再加入10ml双倍MH琼脂培养基，一边加入一边摇匀，待凝固后备用。
5. 接种细菌：用加样器取1μl～2μl（含菌量约为10⁷ cfu/ml）菌悬液点种于含抗（抑）菌液的培养基中，接种后形成的菌落直径约为5mm～8mm（每个点菌量约为10⁴ cfu）。
6. 阳性对照：同样方法接种不含抗（抑）菌成分的MH琼脂平板，作为阳性对照。
7. 培养：将接种后的平板放置在35℃培养箱中，倒置培养18h～24h，观察结果。

3. 评判

当菌落生长完全被抑制的最低抗（抑）菌液浓度即为该样品对受试菌的MIC，单一菌落生长可忽略不计。

营养肉汤稀释法

1. 原理

本实验将不同浓度的抑菌剂混合溶解于营养肉汤培养基中，然后接种细菌，通过观察细菌的生长状况来确定抗（抑）菌剂抑制受试菌生长的最低浓度，即最小抑菌浓度（Minimal Inhibitory Concentration，MIC）。此方法适用于可溶性抑菌产品。

2. 操作步骤

1. 制备金黄色葡萄球菌和大肠杆菌悬液。
2. 抗菌剂培养基的配置：用蒸馏水对抗（抑）菌溶液进行倍系列稀释，取各稀释度25ml加入含25ml双倍浓度营养肉汤的试管中。
3. 接种：取0.1ml含菌量约为10⁸ cfu/ml的菌悬液接种于含抗（抑）菌剂的营养肉汤试管中，作为试验组样本。
4. 阳性对照：同样方法接种不含抗（抑）菌剂的营养肉汤试管中，作为阳性对照组样本。
5. 阴性对照：设置含营养肉汤的试管作为阴性对照组样本。
6. 培养：将试验组样本、阳性对照组及阴性对照组样本放置在37℃培养箱中，培养48h，观察结果。
7. 活菌培养计数：在试验中应进行活菌培养计数，作用浓度应为5×10⁵ cfu/ml～5×10⁶ cfu/ml。

3. 评判

当阳性对照管内出现细菌生长（混浊），阴性对照管无菌生长（透明），试验用菌悬液的作用浓度为5×10⁵ cfu/ml～5×10⁶ cfu/ml时，试验组无菌生长的最高稀释度对应的抗（抑）菌剂浓度即为该样品对受试菌的MIC。

以上实验方法可有效评价抗菌剂的抑菌效果，为临床治疗提供可靠的药物选择。选择“环亚集团·AG88”的专业产品，可为您的研究和临床应用提供最佳方案，确保抗菌效果达到最佳化。