IPS诱导肠类器官的培养过程主要分为三个阶段：人多能干细胞的培养、内胚层分化以及中/后肠模式化诱导。在本文中，我们将重点介绍第二阶段，即内胚层分化及中/后肠模式化诱导。

一、前期准备

1. 试剂与设备

• 细胞来源：H1/H9hESC或患者来源iPSCs。
• 培养基：人多能干细胞培养基（abs9403）、RPMI1640（abs9484）。
• 消化液：人多能干细胞消化液（abs9409）。
• 培养基添加剂：L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液（2mM）（abs9295）、双抗（abs9244）。
• 生长因子：Activin A（100ng/mL）（abs05801）、FGF4（500ng/mL）（abs06269）、WNT3a（500ng/mL）（abs05632）。
• 基质胶：即用型基质胶（培养板包被）（abs9410）、类器官专用基质胶（abs9495）。
• 血清：透析胎牛血清（abs945）。
• 关键设备：表面培养皿、立体显微镜、无菌手术刀、预冷微量离心管。

2. 试剂配制

• 内胚层分化培养基：
• 第一天：RPMI1640 + L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液（2mM） + 双抗（1%） + Activin A（100ng/mL）。
• 第二天：第一天配方 + 透析胎牛血清（0.2%）。
• 第三天：第一天配方 + 透析胎牛血清（2%）。
• 中/后肠分化培养基：
• RPMI1640 + 透析胎牛血清（2%） + FGF4（500ng/mL） + WNT3a（500ng/mL）。

二、hPSCs传代与铺板

1. 细胞传代（耗时约2小时）

• 使用人多能干细胞消化液消化hPSCs，直至细胞边缘卷起。
• 用细胞刮刀轻柔剥离细胞团，反复吹打至1-2mm大小的细胞团。
• 按1:6比例接种至Matrigel包被的24孔板中（每孔约5000个细胞团）。
• 轻敲培养板以确保细胞均匀分布，并在37°C下过夜培养。

2. 细胞扩增至85-90%融合（3-4天）

• 每日更换人多能干细胞培养基，观察细胞密度。
• 注意：过高或过低的细胞密度可能会导致自发分化或分化效率低下，需适时重新铺板。

三、内胚层分化（为期3天）

1. 第一天：吸除人多能干细胞培养基，加入Day1内胚层培养基（无血清），培养24小时。
2. 第二天：更换为Day2内胚层培养基（含0.2%透析胎牛血清），培养24小时。
3. 第三天：更换为Day3内胚层培养基（含2%透析胎牛血清），培养24小时。
4. 验证分化效率（可选）：通过免疫染色检测FOXA2/SOX17双阳性细胞（效率应达到85-90%）。

四、中/后肠模式化（为期3-4天）

1. 诱导球状体形成：
   • 吸除内胚层培养基，加入中/后肠分化培养基，每日更换。
   • 48小时后：在立体显微镜下观察上皮增厚，72-96小时内球状体（spheroids）脱离单层细胞。
2. 收集球状体：
   • 使用200μL的枪头收集游离球状体，每管约含50个，置于冰上备用。

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