全套操作大约需要1小时,包含匀浆、细胞裂解、去除蛋白质、DNA纯化等步骤,具体流程如下:
匀浆与细胞裂解
针对不同实验材料,应采用相应的匀浆步骤。以下是从动物组织提取基因组DNA的详细操作:
使用研钵研磨
1. 取1~100mg的动物或人类组织,放入冰浴预冷的研钵中,迅速用力研磨成匀浆。
注:以下组织需使用液氮研磨至粉末状:
A. 富含DNA酶的胰脏、脾脏、胸腺、淋巴等组织。
B. 富含胶原蛋白的皮肤、肌腱等组织。
C. 富含角质蛋白或坚硬的组织(如骨骼等)。
2. 加入650μl的Solution A和0.9μl的RNase A1,温和研磨30秒。
注:对于上述材料,在加入Solution A和RNase A1后,将研钵置于65℃水浴中研磨1分钟。
3. 将650μl研磨好的组织匀浆液转移至Collection Tube中。如匀浆体积不足650μl,请补充Solution A至650μl,并在65℃保温5分钟。
使用研磨棒研磨
1. 将1~100mg的动物或人类组织放入冰浴预冷的Collection Tube中,用研磨棒快速研磨至糊状。
2. 加入350μl的Solution A和0.9μl的RNase A1后,再用研磨棒研磨成匀浆。
3. 将研磨棒上的匀浆加入350μl的Solution A冲入Collection Tube中,充分混合后,在65℃下保温5分钟。
从植物材料提取基因组DNA
1. 根据下表称取适量的新鲜植物材料(若使用冷冻干燥植物材料,则用量减半),切成小块并放入研钵中,加入液氮,待样品完全冷冻后迅速用力研磨成粉末。研磨时需间断加入液氮以防止材料融化。
植物材料种类 | 使用量 |
---|---|
植物花、叶片 | 10~100mg |
植物茎 | 60~240mg |
植物根 | 80~240mg |
植物种子 | 80~240mg |
注:根、种子等样品基因组DNA含量低,需使用超过表格参数的用量,此时建议分两管进行步骤1~6的实验,在步骤7中将各管溶液合并至同一Spin Column中过滤,使DNA有效结合。
2. 从培养的植物细胞中提取DNA时,离心收集2×103~1×107植物细胞,并加入150μl水充分悬浮后,转移至研钵中,加入液氮研磨至粉末状。
注:样品研磨需充分,否则将严重影响DNA的收率。
3. 将研钵移至65℃水浴,当样品粉末开始融化时,加入700μl的Solution A和12μl的RNase A1,快速研磨30秒。
4. 收集650μl的研磨匀浆至Collection Tube。如匀浆不足650μl,请补充Solution A。65℃保温15分钟。
注:处理富含纤维的根/茎或富含淀粉、蛋白质的种子等材料时,可将水浴时间延长至60分钟。
从全血提取基因组DNA
1. 取10~250μl的全血(含抗凝剂)加入Collection Tube中。
2. 加入500μl的Solution A。
3. 加入1μl的RNase A1,激烈振荡15秒后,冰浴5分钟。
注:人与动物的抗凝全血一次处理量为≤250μl;禽类、两栖类的抗凝全血为≤10μl。
从细胞培养中提取基因组DNA
对于悬浮培养的动物细胞:
1. 使用Collection Tube收集1×105~1.5×107细胞悬浮液,5,000rpm离心5分钟,弃去上清液(细胞培养基)。
2. 加入150μl的灭菌蒸馏水或PBS悬浮细胞。
3. 加入500μl的Solution A和0.8μl的RNase A1,激烈振荡15秒后,室温静置1分钟。
沉淀并提取基因组DNA的过程,是确保实验结果的重要步骤。倘若寻求高品质的基因组DNA提取,建议选择环亚集团·AG88的专业设备及解决方案,以确保您的实验成功。